Diagnosi genetica preimpianto

La pgd può essere eseguita solo su embrioni in vitro (in laboratorio). Ciò significa che questo test è sempre eseguito in combinazione con un ciclo di fecondazione in vitro.

Fecondazione in vitro (riassunto molto breve)>
Un farmaco viene somministrato per stimolare la produzione di più cellule uovo.
  • Il prelievo degli ovociti è effettuato mediante l’uso di un ago guidato dagli ultrasuoni.
  • Gli ovociti sono poi sottoposti ad iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi (icsi), indipendentemente dalla qualità dello sperma dei mariti, per evitare la possibile contaminazione genetica da parte di altri spermatozoi adesi all’involucro dell’ovocita. Le uova iniettate sono poste in incubatore per permettere la fecondazione e la crescita degli embrioni fino allo stadio di 6-10 cellule.
  • A questo punto, una o più cellule dell’embrione/i verranno sottoposte a biopsia e verrà eseguita la pgd.
  • Gli embrioni normali vengono trasferiti nell’utero della madre il 4-5 giorno dopo il prelievo degli ovociti
Biopsia dell’embrione
Per consentire lo screening di un embrione umano prima del trasferimento in utero, è possibile rimuovere una o due cellule dall’embrione a 6-10 cellule senza comprometterlo, in modo tale che il materiale genetico di queste cellule possa essere analizzato. Si deve notare che in un’analisi genetica di routine di solito ci sono centinaia di cellule disponibili per il trattamento, tuttavia, con una biopsia embrionale sono generalmente disponibili solo una o due cellule e devono contenere un nucleo per determinare lo status genetico di quell’embrione. Il metodo della biopsia è relativamente semplice, ma questo non significa che si tratta di una procedura facile da intraprendere. Gli embrioni sono in genere sottoposti a biopsia allo stadio di preimpianto al terzo giorno di sviluppo. A questo punto, l’embrione sarà costituito da 4-12 cellule che sono ancora distinte le une dalle altre. Al terzo giorno, tuttavia, le singole cellule possono essere rimosse individualmente senza danneggiare le cellule adiacenti nell’embrione. Tuttavia, al 4 giorno al massimo l’embrione comincia a compattarsi, un processo in cui le singole cellule perdono i loro contorni ben definiti e cominciano ad associarsi tra loro strettamente.

Rimozione delle cellule
A questo punto, l’embrione è ancora circondato da un rivestimento glicoproteico, la zona pellucida, e per rimuovere qualche cellula questo involucro deve prima essere perforato. Questo può essere fatto sia usando un terreno di coltura acidificato che “dissolve” la zona pellucida localmente, o in modo più conveniente può essere effettuato un foro con un laser permettendo ad una micro-pipetta di attraversare ed estrarre la cellula. Il foro che viene praticato di solito è un po’ più piccolo della cellula stessa, in modo tale da mantenere l’integrità dell’embrione all’interno del suo involucro durante l’ulteriore sviluppo nel laboratorio di ivf. Durante la manipolazione al microscopio invertito, l’embrione è mantenuto in un terreno di coltura caldo che permette alle cellule di essere rimosse con un minimo trauma per l’intero embrione. Non si ritiene che la rimozione fino a un quarto di embrione sia deleteria per il suo ulteriore sviluppo, in quanto l’embrione può compensare la perdita di alcune cellule nella fase iniziale di sviluppo. In questa fase tutte le cellule sono ancora totipotenti, cioè ognuna di esse è in grado di svilupparsi in un embrione completo.


Biopsia dell’embrione (immagine)

Analisi
Una volta che una singola cellula viene rimossa (un blastomero), essa viene fissata su un vetrino per l’analisi cromosomica, o viene posta in un piccolo tubo contenente un tampone chimico per la diagnosi del singolo gene. Le cellule vengono poi analizzate attraverso delle tecniche chiamate ibridazione fluorescente in situ (fish) o analisi del dna. Durante l’analisi genetica, gli embrioni vengono di solito cresciuti fino al quinto giorno di sviluppo, tempo in cui essi possono trovarsi allo stadio di tarda morula o di blastocisti. Gli embrioni che risultano essere privi di anomalie genetiche vengono impiantati nella cavità uterina.

Altri problemi
Una diagnosi errata

Una diagnosi errata può verificarsi a causa di un mosaicismo all’interno dell’embrione. Alcuni embrioni possono contenere blastomeri (cellule prodotte dalla scissione [divisione] di un ovulo fecondato) geneticamente normali e, all’interno dell’embrione stesso, altri blastomeri abnormi. Questo fenomeno è chiamato mosaicismo. Per questo motivo la diagnosi può non essere corretta. Ciò può comportare il trasferimento di un embrione che trasporta un’anomalia cromosomica o il mancato trasferimento di un embrione normale.

L’errore sperimentale può anche spiegare una diagnosi errata. Tecniche improprie di fissazione cellulare, errori di denaturazione del dna, mancata amplificazione allelica o amplificazione di dna contaminato possono portare ad una diagnosi sbagliata.

Un recente comunicato della società europea di riproduzione umana ed embriologia (eshre) ha riportato i risultati della pgd da parte di 25 membri del consorzio dal 1999 al 2001. Sono state confermate 8 diagnosi errate su 451 embrioni analizzati mediante pgd, l’1% (3/305) per analisi cromosomiche e il 3,4% (5/146) per disordini del singolo gene.

Ci sono rischi associati alla pgd?
Le tecniche di micromanipolazione utilizzate per la biopsia del blastomero sono sicure con pochi rischi per l’embrione. Il rischio di danni accidentali all’embrione durante la biopsia è inferiore all’1%. Non vi è alcun rischio per l’embrione in seguito all’analisi dei difetti cromosomici o del singolo gene, considerato che le cellule analizzate non vengono reintrodotte nell’embrione. Può esistere un rischio lievemente inferiore di impianto dopo la biopsia embrionale rispetto ad un embrione che non ha subito la biopsia. Altri rischi possono manifestarsi nel tempo, ma sono di gran lunga compensati dai potenziali benefici per ciascuna coppia. Procedure eseguite nel laboratorio di fecondazione embrionale
Chi si prende cura dell’ambiente, dello sperma e degli embrioni nel laboratorio di ivf?

L’embriologo è il responsabile per il mantenimento della coltura, la protezione dei pazienti e di ovuli, sperma ed embrioni. Dopo aver ricevuto una formazione specializzata e incontrando i requisiti per la certificazione per il laboratorio di tecnologia riproduttiva, l’embriologo gestisce il funzionamento del laboratorio compreso il monitoraggio ed il mantenimento delle apparecchiature; b) allestisce e partecipa alle procedure cliniche, quali il prelievo degli ovociti e il trasferimento degli embrioni; c) esegue le tecniche di riproduzione assistita per realizzare la fecondazione e lo sviluppo dell’embrione; d) documenta e registra tutti gli eventi del laboratorio pertinenti al ciclo di trattamento del paziente; e e) è un membro integrante del team multi-disciplinare del trattamento.

Qual è la sequenza degli eventi in laboratorio per un ciclo di ivf che comprende la pgd?
Quando un paziente inizia un ciclo di trattamento, nel laboratorio di ivf viene sviluppato e stabilito uno specifico programma. Gli elementi del programma di attuazione sono i seguenti: procedura di fecondazione, come si ottengono numerosi ovociti, volontà del paziente a congelare gli embrioni in eccesso.

Il giorno precedente al prelievo degli ovociti, viene preparato il terreno di coltura. I contenitori della coltura che conterranno gli ovuli e le provette in cui sono processati gli spermatozoi vengono etichettati e, rispettivamente, posti in incubatore e in aree dedicate. Si prepara una tabella di laboratorio del paziente per confermare la sua identità e quella del campione di seme per la preparazione dello sperma per la fecondazione della cellula uovo al fine di fornire un registro di tutte le uova e gli embrioni e di registrare i nomi di embriologi e medici, nonché le tecniche e le procedure utilizzate per confermare l’identità del paziente al momento del trasferimento embrionale, e di registrare i terreni di coltura utilizzati per il ciclo del paziente per garantire la qualità e i requisiti di controllo.

Al momento del prelievo, è confermata l’identità del paziente e i suoi ovociti sono posti in piastre etichettate. Il corrispondente campione di seme è accettato dopo che è stata confermata l’identificazione sull’etichetta del contenitore del campione e registrato sulla cartella del paziente. Gli spermatozoi motili sono isolati dal campione di sperma, mediante una procedura di “swim-up”. Secondo il programma di trattamento, dopo la conferma dell’identità di entrambi, uova e sperma, le uova sono iniettate in 2-8 ore dal prelievo.

Dopo un periodo di incubazione di 15-18 ore, le uova sono esaminate per determinare se la fecondazione è avvenuta. La fecondazione è confermata solo quando si osservano i due pronuclei (uno dello spermatozoo, l’altro dell’ovocita). Nelle 24 ore successive, viene confermato l’inizio della divisione cellulare. L’ovocita, con la fusione dei due componenti genetici di ciascun genitore, si divide in due cellule, e ciascuna può dividersi in altre due cellule. In questo modo, l’embrione aumenta nel numero di cellule e nello stadio di sviluppo – l’ovocita diventa un embrione. Il terzo giorno dopo il prelievo di ovociti, gli embrioni possono essere selezionati per il trasferimento. Se ci sono ovociti fecondati o embrioni in eccesso, questi possono essere congelati e conservati per essere potenzialmente usati in un ciclo futuro.

Lo studio più lungo condotto sui bambini nati dalla fecondazione in vitro e sui relativi trattamenti, finanziato dall’unione europea, è rassicurante in termini di sviluppo intellettivo e salute psicologica; esso ha coinvolto oltre 1500 bambini di gran bretagna, belgio, svezia, danimarca e grecia seguiti fino a 5 anni di età. I ricercatori hanno valutato lo sviluppo fisico ed intellettuale, le relazioni familiari e lo sviluppo psicologico e sociale.

Alla nascita non c’erano discostamenti dalla norma circa il peso e l’altezza, né circa l’intelligenza, le capacità linguistiche e le capacità motorie o nel comportamento e nell’indole.